實驗過程中為了方便保存和批次管理，很多細胞都會經(jīng)過凍存。需要實驗時再從液氮中取出復(fù)蘇。不過，當(dāng)后續(xù)實驗涉及電轉(zhuǎn)時，一個容易被忽略的問題是：細胞剛剛復(fù)蘇完成以后，能不能直接進行電轉(zhuǎn)？

從實驗控制角度來看，一般不建議單純根據(jù)“已經(jīng)復(fù)蘇多少小時"決定是否進行電轉(zhuǎn)，更重要的是判斷細胞是否真正恢復(fù)到了適合實驗的狀態(tài)。

一、復(fù)蘇完成只是細胞恢復(fù)過程的開始

細胞從凍存狀態(tài)恢復(fù)到培養(yǎng)狀態(tài)，需要經(jīng)歷溫度變化、凍存保護劑去除、滲透壓重新平衡以及重新適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境等過程。

顯微鏡下看到細胞已經(jīng)存在，并不代表細胞已經(jīng)恢復(fù)。

部分細胞在復(fù)蘇早期可能表現(xiàn)出貼壁緩慢、形態(tài)異常、生長停滯或者較多細胞碎片。這些狀態(tài)都會增加后續(xù)實驗的不確定性。

而電轉(zhuǎn)本身又會對細胞膜產(chǎn)生一次短時間物理刺激。

如果在細胞尚未充分恢復(fù)時立即進行下一次刺激，最終獲得的數(shù)據(jù)往往更難解釋。

二、不要只看細胞“活沒活"

判斷復(fù)蘇細胞是否可以用于電轉(zhuǎn)，不能只根據(jù)存活率一個指標(biāo)。

即使活細胞比例看起來還可以，如果細胞生長狀態(tài)不穩(wěn)定、形態(tài)沒有恢復(fù)或者培養(yǎng)體系中存在較多碎片，也說明細胞仍處于調(diào)整階段。

更加實用的判斷方式，是同時觀察細胞形態(tài)、生長趨勢和整體狀態(tài)是否趨于穩(wěn)定。

對于貼壁細胞，可以觀察是否正常貼壁、伸展以及進入穩(wěn)定增殖狀態(tài)。

對于懸浮細胞，則需要關(guān)注細胞分散情況、形態(tài)、增殖以及碎片比例。

當(dāng)這些指標(biāo)逐漸恢復(fù)到日常培養(yǎng)時的正常水平以后，再安排后續(xù)實驗通常更容易獲得可比較的數(shù)據(jù)。

三、為什么不同實驗室給出的時間并不一樣

有些實驗人員習(xí)慣復(fù)蘇后培養(yǎng)一天再實驗，有些細胞則需要更長恢復(fù)時間。

這并不一定是誰對誰錯。

不同細胞類型、凍存方法、凍存時間以及培養(yǎng)體系都會影響恢復(fù)速度。

因此，“復(fù)蘇24小時以后一定可以電轉(zhuǎn)"這樣的固定結(jié)論并不嚴(yán)謹(jǐn)。

尤其是對于本身狀態(tài)波動較大的細胞，更適合使用狀態(tài)判斷，而不是只使用時間判斷。

如果實驗室已經(jīng)建立穩(wěn)定SOP，可以繼續(xù)按照經(jīng)過驗證的流程執(zhí)行；如果正在建立新的體系，則應(yīng)該把復(fù)蘇狀態(tài)作為一個需要記錄的實驗條件。

四、直接使用剛復(fù)蘇細胞容易增加哪些變量

使用剛復(fù)蘇細胞進行實驗，最大的風(fēng)險不是一定失敗，而是增加額外變量。

假設(shè)這一批實驗結(jié)果比上一批差，很難立即判斷到底是電脈沖設(shè)置的問題、樣品的問題，還是細胞本身沒有恢復(fù)好。

這會讓后續(xù)排查變得復(fù)雜。

實驗優(yōu)化的基本原則之一，是盡量一次只改變少量變量。

因此，在測試電轉(zhuǎn)條件時，最好首先保證細胞來源、培養(yǎng)階段以及復(fù)蘇狀態(tài)相對穩(wěn)定。

只有基礎(chǔ)條件穩(wěn)定，比較不同實驗方案才有意義。

五、可以建立自己的“可電轉(zhuǎn)狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)"

相比規(guī)定一個固定時間，更建議實驗室為常用細胞建立狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)。

例如記錄正常細胞形態(tài)、培養(yǎng)密度、生長速度、復(fù)蘇后的培養(yǎng)階段以及異常細胞比例。

經(jīng)過幾次穩(wěn)定實驗以后，就能夠逐漸確定什么狀態(tài)下進行操作結(jié)果更可靠。

對于長期開展同類型實驗的實驗室，這種方法還可以減少不同實驗人員之間的操作差異。

新人不需要依靠“感覺細胞差不多了"，而是根據(jù)已有記錄進行判斷。

六、實驗計劃也要給細胞恢復(fù)留出時間

有時候?qū)嶒炄藛T急于趕實驗進度，在當(dāng)天復(fù)蘇細胞，同時準(zhǔn)備第二天直接開展所有后續(xù)操作。

如果細胞狀態(tài)沒有達到要求，就容易陷入一個問題：樣品已經(jīng)準(zhǔn)備好了，不做實驗就會浪費，于是只能硬著頭皮繼續(xù)。

更加合理的方法是在排實驗計劃時預(yù)留恢復(fù)時間。

先確認(rèn)細胞達到穩(wěn)定狀態(tài)，再進入關(guān)鍵實驗階段。

雖然表面上多等待了一段時間，但從減少失敗實驗和重復(fù)實驗的角度看，整體效率反而可能更高。

結(jié)語

凍存細胞復(fù)蘇以后能不能進行電轉(zhuǎn)，真正需要判斷的不是一個固定小時數(shù)，而是細胞有沒有恢復(fù)到穩(wěn)定、可重復(fù)的實驗狀態(tài)。

復(fù)蘇后的培養(yǎng)時間只是參考條件之一。

如果能夠把細胞形態(tài)、生長趨勢和培養(yǎng)狀態(tài)一起納入判斷，并形成自己的記錄標(biāo)準(zhǔn)，就能夠減少細胞自身狀態(tài)給后續(xù)電轉(zhuǎn)實驗帶來的額外干擾。