電轉(zhuǎn)完成以后，很多實(shí)驗(yàn)人員最先關(guān)注的是結(jié)果什么時(shí)候能夠看到。有的人做完幾個(gè)小時(shí)就開(kāi)始檢測(cè)，也有人習(xí)慣第二天統(tǒng)一觀察。實(shí)際上，“電轉(zhuǎn)后多久檢測(cè)"并不存在一個(gè)適用于所有實(shí)驗(yàn)的固定答案，因?yàn)闄z測(cè)時(shí)間不僅和電轉(zhuǎn)過(guò)程有關(guān)，更和導(dǎo)入物類(lèi)型、檢測(cè)指標(biāo)以及細(xì)胞自身的生物學(xué)過(guò)程有關(guān)。

如果檢測(cè)時(shí)間選擇不合適，即使電轉(zhuǎn)本身已經(jīng)成功，也可能得到“信號(hào)很弱"“沒(méi)有明顯變化"甚至“實(shí)驗(yàn)失敗"的判斷。因此，在安排實(shí)驗(yàn)時(shí)，檢測(cè)時(shí)間最好和電轉(zhuǎn)條件一起提前設(shè)計(jì)。

一、電轉(zhuǎn)完成不等于馬上出現(xiàn)最終結(jié)果

電轉(zhuǎn)的主要作用，是通過(guò)短時(shí)間電脈沖使細(xì)胞膜出現(xiàn)暫時(shí)性的通透狀態(tài)，使外源物質(zhì)能夠進(jìn)入細(xì)胞。

電脈沖結(jié)束以后，實(shí)驗(yàn)實(shí)際上才進(jìn)入下一階段。

細(xì)胞膜需要逐漸恢復(fù)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白或其他分子還需要經(jīng)歷進(jìn)一步的表達(dá)、定位或發(fā)揮功能的過(guò)程。因此，“物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞"和“檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)結(jié)果"之間通常存在時(shí)間差。

例如，檢測(cè)細(xì)胞即時(shí)狀態(tài)和檢測(cè)蛋白表達(dá)，所需要等待的時(shí)間明顯不同。

這也是為什么不能只根據(jù)“電轉(zhuǎn)已經(jīng)結(jié)束多久"來(lái)機(jī)械決定檢測(cè)時(shí)間。

二、先確定自己到底要檢測(cè)什么

安排檢測(cè)時(shí)間之前，可以先把檢測(cè)目標(biāo)分成幾類(lèi)。

第一類(lèi)是觀察電轉(zhuǎn)后的即時(shí)狀態(tài)。

例如觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜恢復(fù)情況或者早期細(xì)胞損傷。這類(lèi)觀察往往可以在電轉(zhuǎn)后的較早階段進(jìn)行。其目的不是判斷最終表達(dá)結(jié)果，而是了解細(xì)胞能否順利從脈沖刺激中恢復(fù)。

第二類(lèi)是檢測(cè)外源物質(zhì)表達(dá)。

如果實(shí)驗(yàn)需要等待進(jìn)入細(xì)胞的核酸產(chǎn)生表達(dá)信號(hào)，就需要給細(xì)胞留出轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程所需要的時(shí)間。過(guò)早檢測(cè)可能只看到很弱的信號(hào)。

第三類(lèi)是檢測(cè)進(jìn)一步的生物學(xué)效應(yīng)。

例如某種基因操作最終需要通過(guò)基因型、蛋白水平或功能變化進(jìn)行判斷，此時(shí)檢測(cè)時(shí)間往往還要更晚。

因此，同一次實(shí)驗(yàn)可能設(shè)置多個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，而不是只檢測(cè)一次。

三、為什么檢測(cè)太早容易誤判

實(shí)驗(yàn)人員最容易出現(xiàn)的問(wèn)題之一，就是看到早期檢測(cè)結(jié)果不好以后立即調(diào)整電轉(zhuǎn)參數(shù)。

實(shí)際上，問(wèn)題可能根本不在電轉(zhuǎn)過(guò)程。

例如細(xì)胞已經(jīng)成功接受遞送，但目標(biāo)信號(hào)尚未達(dá)到適合檢測(cè)的水平。此時(shí)如果直接提高電壓、增加脈沖次數(shù)或者調(diào)整其他參數(shù)，反而可能把原本正常的條件改壞。

所以，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果偏低時(shí)，可以先確認(rèn)三個(gè)問(wèn)題：

檢測(cè)的是什么指標(biāo)？

該指標(biāo)從遞送到出現(xiàn)信號(hào)需要多長(zhǎng)時(shí)間？

目前檢測(cè)時(shí)間是不是落在合理窗口內(nèi)？

只有排除了時(shí)間因素以后，再判斷是否需要調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，會(huì)更加可靠。

四、不同遞送任務(wù)的時(shí)間窗口并不一樣

對(duì)于不同實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)窗口通常有所區(qū)別。

一些作用較快的遞送物，在電轉(zhuǎn)后較早階段就可能出現(xiàn)可檢測(cè)信號(hào)；而依賴持續(xù)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，往往需要更長(zhǎng)時(shí)間。

涉及基因編輯時(shí)情況會(huì)更加復(fù)雜。物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞只是第一步，后續(xù)還需要完成靶向、切割、修復(fù)等過(guò)程，因此早期觀察和最終編輯結(jié)果檢測(cè)通常不能使用同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

這里最重要的不是記住某一個(gè)固定小時(shí)數(shù)，而是根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理確定檢測(cè)窗口。

如果實(shí)驗(yàn)方案或者試劑說(shuō)明中已經(jīng)提供推薦時(shí)間，應(yīng)優(yōu)先以經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的體系為基礎(chǔ)，而不是直接套用其他實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間設(shè)置。

五、建議設(shè)置“早期+主要+驗(yàn)證"三個(gè)時(shí)間點(diǎn)

對(duì)于剛建立的新實(shí)驗(yàn)條件，可以把檢測(cè)設(shè)計(jì)得更加完整一些。

早期時(shí)間點(diǎn)主要觀察細(xì)胞狀態(tài)以及明顯異常。

主要檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)用于獲得實(shí)驗(yàn)的核心數(shù)據(jù)。

如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要進(jìn)一步確認(rèn)，還可以增加一個(gè)后期驗(yàn)證時(shí)間點(diǎn)。

這種設(shè)計(jì)比“第二天統(tǒng)一檢測(cè)一次"更容易判斷問(wèn)題出現(xiàn)在哪個(gè)階段。

如果早期細(xì)胞狀態(tài)正常，但后續(xù)沒(méi)有目標(biāo)信號(hào)，排查方向應(yīng)更多放在遞送物質(zhì)量、表達(dá)體系以及檢測(cè)方法。

如果早期階段已經(jīng)出現(xiàn)大量異常，則應(yīng)優(yōu)先檢查電轉(zhuǎn)過(guò)程和細(xì)胞處理過(guò)程。

不同階段的數(shù)據(jù)能夠幫助實(shí)驗(yàn)人員縮小問(wèn)題范圍。

六、檢測(cè)時(shí)間也應(yīng)該成為實(shí)驗(yàn)記錄的一部分

很多實(shí)驗(yàn)記錄會(huì)詳細(xì)記錄電壓、脈寬、脈沖次數(shù)和細(xì)胞數(shù)量，卻只寫(xiě)一個(gè)簡(jiǎn)單的“第二天檢測(cè)"。

實(shí)際上，檢測(cè)時(shí)間同樣屬于影響最終數(shù)據(jù)的重要實(shí)驗(yàn)變量。

建議記錄實(shí)際電轉(zhuǎn)完成時(shí)間、恢復(fù)培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)間、第一次檢測(cè)時(shí)間以及最終數(shù)據(jù)采集時(shí)間。

特別是在進(jìn)行多批次實(shí)驗(yàn)比較時(shí)，如果每批實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)時(shí)間相差較大，就可能人為增加結(jié)果波動(dòng)。

結(jié)語(yǔ)

“電轉(zhuǎn)后多久檢測(cè)"看似只是一個(gè)時(shí)間安排問(wèn)題，實(shí)際上直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。

與其尋找一個(gè)所有實(shí)驗(yàn)都能使用的固定時(shí)間，不如先確定遞送物類(lèi)型、檢測(cè)指標(biāo)以及最終實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，再選擇合適的檢測(cè)窗口。

尤其是在建立新實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，把檢測(cè)時(shí)間作為獨(dú)立變量記錄和驗(yàn)證，可以減少因?yàn)闄z測(cè)過(guò)早或過(guò)晚造成的誤判，也能夠讓后續(xù)實(shí)驗(yàn)比較更加可靠。