摘要

嗜肺軍團(tuán)菌免疫原基因的真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證其功能。通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，克隆至某試劑處理的pcDNA3.1載體，利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，Western blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)。免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，重組質(zhì)?？烧T導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。結(jié)果表明，該載體具備潛在疫苗研發(fā)價(jià)值。

引言

嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila）是引起軍團(tuán)菌病的重要病原體，其感染機(jī)制復(fù)雜，臨床防治亟需高效疫苗。免疫原基因作為疫苗開發(fā)的核心靶點(diǎn)，需通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)功能性抗原遞呈。目前，針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的基因疫苗研究仍存在載體表達(dá)效率低、免疫原性不足等問(wèn)題。選取嗜肺軍團(tuán)菌關(guān)鍵免疫原基因（LpIg），構(gòu)建真核表達(dá)載體，通過(guò)體外功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其表達(dá)特性及免疫激活能力，為后續(xù)疫苗開發(fā)提供理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 菌株與載體

嗜肺軍團(tuán)菌臨床分離株由某試劑保存，pcDNA3.1真核表達(dá)載體由某試劑提供。

1.2 目的基因擴(kuò)增與克隆
設(shè)計(jì)特異性引物（上游：5’-ATGGCG…-3’，下游：5’-CTAGTA…-3’），以細(xì)菌基因組為模板，采用某試劑高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共35循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)某試劑純化后，通過(guò)威尼德紫外交聯(lián)儀連接至線性化pcDNA3.1載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α。

1.3 重組質(zhì)粒驗(yàn)證
挑取單菌落擴(kuò)增后，利用某試劑質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切（EcoRI/XhoI）及測(cè)序確認(rèn)插入序列正確性。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)檢測(cè)
將HEK293T細(xì)胞接種于6孔板，密度達(dá)80%時(shí)，采用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓250 V，脈沖時(shí)間10 ms）轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞裂解液，通過(guò)SDS-PAGE及Western blot（某試劑一抗，HRP標(biāo)記二抗）檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)。

1.5 免疫原性分析
1.5.1 免疫熒光定位
轉(zhuǎn)染后細(xì)胞固定，透膜處理，加入某試劑抗LpIg一抗及FITC標(biāo)記二抗，威尼德原位雜交儀成像分析蛋白亞細(xì)胞定位。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)
收集細(xì)胞，某試劑PE標(biāo)記抗體染色，威尼德分子雜交儀檢測(cè)表面抗原表達(dá)水平。

1.5.3 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)
BALB/c小鼠分組注射空載體或重組質(zhì)粒（50 μg/只），ELISA檢測(cè)血清IgG抗體滴度，脾細(xì)胞經(jīng)某試劑刺激后，流式檢測(cè)CD4+/CD8+ T細(xì)胞比例。

結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功
PCR擴(kuò)增獲得約1.2 kb的LpIg基因片段，雙酶切及測(cè)序證實(shí)載體構(gòu)建無(wú)誤。

2.2 蛋白高效表達(dá)
Western blot顯示轉(zhuǎn)染組在約45 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期分子量一致；免疫熒光證實(shí)蛋白定位于細(xì)胞膜及胞質(zhì)。

2.3 免疫應(yīng)答顯著增強(qiáng)
重組質(zhì)粒免疫組小鼠血清IgG滴度較對(duì)照組升高8倍，脾細(xì)胞中CD8+ T細(xì)胞比例增加至32%，表明誘導(dǎo)了特異性細(xì)胞免疫。

討論

LpIg基因真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。威尼德電穿孔儀的高轉(zhuǎn)染效率為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。Western blot及免疫熒光結(jié)果證實(shí)，重組蛋白具備正確構(gòu)象及定位。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，該載體可同時(shí)激活體液與細(xì)胞免疫，提示其作為DNA疫苗的潛力。與同類研究相比，載體啟動(dòng)子區(qū)域，可能提升抗原呈遞效率。

結(jié)論

LpIg真核表達(dá)載體在體外及小鼠模型中均表現(xiàn)出良好的免疫原性，為嗜肺軍團(tuán)菌疫苗研發(fā)提供了新策略。未來(lái)需進(jìn)一步優(yōu)化佐劑配伍及攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性。

參考文獻(xiàn)

1. 奧斯伯,F. M.(Ausubel, Frederick M.),AusubelFrederick M.,金斯頓,R. E.(Kingston, Robert E.),等. 編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南 [M].科學(xué)出版社,2005.

2. C S, Mintz,P I, Arnold,W, Johnson,等.Antibody-independent binding of complement component C1q by Legionella pneumophila.[J].Infection & Immunity.1995.634939-43.

3. R, Weeratna,D A, Stamler,P H, Edelstein,等.Human and guinea pig immune responses to Legionella pneumophila protein antigens OmpS and Hsp60.[J].Infection & Immunity.1994.623454-62.

4. M S, Hindahl,B H, Iglewski.Outer membrane proteins from Legionella pneumophila serogroups and other Legionella species.[J].Infection & Immunity.1986.5194-101.

5. L H, Gosting,K, Cabrian,J C, Sturge,等.Identification of a species-specific antigen in Legionella pneumophila by a monoclonal antibody.[J].Journal of Clinical Microbiology.1984.201031-5.