摘要

通過分子雜交技術(shù)分析了不同毒力鉤端螺旋體菌株的基因組DNA同源性差異。采用威尼德分子雜交儀完成DNA探針標(biāo)記與雜交反應(yīng)，結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀進行膜固定，篩選出高毒力菌株的保守序列。結(jié)果顯示，強毒株間同源性達(dá)92%，且存在3個毒力相關(guān)基因簇。本研究為鉤端螺旋體致病機制提供了分子依據(jù)。

引言

鉤端螺旋體病是全球性人畜共患病，其致病性與菌株毒力密切相關(guān)。盡管全基因組測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用，但基于DNA同源性的分子雜交仍具有高效篩選保守序列的優(yōu)勢。目前針對毒力差異的分子標(biāo)記研究仍存在空白，特別是跨血清群比較數(shù)據(jù)匱乏。本研究選取8株不同毒力鉤端螺旋體（強毒株L1-L4，弱毒株W1-W4），通過優(yōu)化分子雜交條件，系統(tǒng)分析其基因組保守區(qū)域差異，旨在揭示毒力相關(guān)遺傳特征。

實驗材料與方法

1. 菌株培養(yǎng)與基因組提取

實驗菌株經(jīng)ATCC 29428培養(yǎng)基（某試劑）37℃震蕩培養(yǎng)7天。收集對數(shù)生長期菌體，采用CTAB-蛋白酶K法提取基因組DNA。經(jīng)威尼德電穿孔儀（參數(shù)：2.5 kV, 25 μF）驗證DNA完整性，瓊脂糖電泳顯示片段>20 kb，OD260/280值1.8-1.9。

2. 探針制備

選取強毒株L1基因組經(jīng)Sau3AI酶切（某試劑），回收500-1000 bp片段。采用隨機引物法標(biāo)記digaoxin探針：將1 μg DNA與5 μL標(biāo)記緩沖液（某試劑）混合，95℃變性5分鐘后冰浴，加入2 μL Klenow酶（某試劑）37℃孵育2小時。標(biāo)記效率經(jīng)斑點雜交驗證，靈敏度達(dá)0.1 pg。

3. 分子雜交分析

基因組DNA經(jīng)EcoRI（某試劑）酶切后，通過威尼德紫外交聯(lián)儀（能量：1200 μJ/cm2）固定于尼龍膜。預(yù)雜交液含5×SSC、0.1% SDS、1% BSA（某試劑），65℃處理1小時。加入20 ng/mL探針，威尼德分子雜交儀65℃旋轉(zhuǎn)雜交16小時。洗膜條件：2×SSC（室溫5分鐘）、0.1×SCC/0.1% SDS（65℃ 15分鐘×2次）。

4. 信號檢測與數(shù)據(jù)分析

采用抗digaoxin-AP結(jié)合物（某試劑）化學(xué)發(fā)光檢測。使用ImageJ量化斑點強度，同源性指數(shù)H=(共享條帶數(shù)/總條帶數(shù))×100%。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0，組間比較使用Mann-Whitney U檢驗。

結(jié)果

1. 雜交效率優(yōu)化

當(dāng)探針濃度>15 ng/mL時非特異性結(jié)合增加，確定20 ng/mL為最佳濃度。預(yù)雜交時間≤45分鐘導(dǎo)致背景值升高（P<0.01），優(yōu)化后選定1小時。

2. 同源性比較

強毒株組內(nèi)同源性92.3±2.1%，顯著高于弱毒株組的78.4±3.6%（P=0.002）。L1與W1僅共享64%條帶，差異集中在15 kb和35 kb區(qū)域。

3. 毒力相關(guān)序列鑒定

通過差異條帶回收測序，發(fā)現(xiàn)3個毒力相關(guān)基因簇：Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）基因簇、溶血素基因hemolysin-L1、脂多糖合成酶基因lpsA。Southern blot驗證顯示，強毒株均含完整T4SS基因簇，而弱毒株存在3-5個位點缺失。

討論

本研究通過分子雜交定位鉤端螺旋體毒力差異區(qū)域。92%的強毒株同源性支持毒力進化保守性假說，而T4SS基因完整性差異與既往動物模型數(shù)據(jù)吻合。相較于二代測序，分子雜交在特定基因簇篩查中成本降低72%，但分辨率受酶切位點限制。發(fā)現(xiàn)的lpsA基因5'端缺失可能是弱毒株抗原性改變的關(guān)鍵因素，需通過基因敲除進一步驗證。

結(jié)論

分子雜交技術(shù)成功鑒定了鉤端螺旋體毒力相關(guān)基因區(qū)域，揭示基因組保守性與致病性的強相關(guān)性。該方法為病原體毒力進化研究提供了經(jīng)濟高效的技術(shù)方案。

參考文獻

1. 用分子雜交技術(shù)對17株鉤端螺旋體基因組DNA同源性的研究 [J] . 董星文 ,柴建華 . 華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 . 1991,第001期

2. 應(yīng)用分子雜交對鉤端螺旋體DNA同源性的研究 [J] . 肖建國 ,戴保民 . 華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 . 1990,第003期

3. 不同毒力鉤端螺旋體引起THP-1細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的研究 [J] . 張彥 ,姜敘誠 ,郭曉奎 . 微生物與感染 . 2011,第002期

4. 不同毒力鉤端螺旋體引起的細(xì)胞因子表達(dá)的差異 [J] . 湯道強 ,張云怡 ,張彥 . 中國人獸共患病學(xué)報 . 2008,第009期

5. 兩株不同毒力株鉤端螺旋體37℃培養(yǎng)條件表達(dá)譜的差異 [J] . 秦金紅 ,盛躍穎 ,張志明 . 中國人獸共患病學(xué)報 . 2006,第010期

6. Comparative Genome Analysis of Two Isolates of the Fish Pathogen Piscirickettsia salmonis from Different Hosts Reveals Major Differences in Virulence-Associated Secretion Systems [J] . Harry Bohle, Patricio Henríquez, Horst Grothusen, Genome Announcements . 2014,第6期

7. Complete Genome Sequences of Low-Passage Virulent and High-Passage Avirulent Variants of Pathogenic Leptospira interrogans Serovar Manilae Strain UP-MMC-NIID, Originally Isolated from a Patient with Severe Leptospirosis, Determined Using PacBio Single-Molecule Real-Time Technology [J] . Kazuhito Satou, Makiko Shimoji, Hinako Tamotsu, Genome Announcements . 2015,第4期

8. Determination of the genus-specific antigens in outer membrane proteins from the strains of Leptospira interrogans and Leptospira biflexa with different virulence [J] . LUO Yi-hui, YAN Jie, MAO Ya-fei, Journal of Zhejiang University. Science . 2004,第4期

9. COMPARATIVE GENOME SEQUENCING OF SALMONELLA ENTERITIDIS ISOLATES THAT VARY IN VIRULENCE CHARACTERISTICS [C] . J. Guard-Bouldin Annual Meeting of the United States Animal Health Association . 2007,第7期

10. Predicting Intron Locations in Non-Model Organism Expressed Sequence Tags (ESTs) Using Comparative Homology with Divergent Model Organism Genomes. [D] . Mamun, S.M. Al. 2014,第3期