摘要：本研究旨在將細(xì)胞電通透技術(shù)應(yīng)用于DNA肌肉轉(zhuǎn)染，通過優(yōu)化電場強(qiáng)度、脈沖時值和質(zhì)粒劑量等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)高效電轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)采用增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）基因質(zhì)粒作為報告基因，注射到小鼠脛前肌后給予特定電脈沖，轉(zhuǎn)染率顯著提高。該方法為基因治療及體內(nèi)基因表達(dá)研究提供了新思路和應(yīng)用前景。

引言

綠色熒光蛋白（GFP）是一種來自水母的蛋白質(zhì)，具有更好的熒光性質(zhì)，能夠在特定波長光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。近年來，GFP被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中，特別是在轉(zhuǎn)基因動物研究中得到了廣泛認(rèn)可。利用GFP基因的表達(dá)，科學(xué)家可以追蹤細(xì)胞、組織以及整個生物體系的運(yùn)動和功能。在轉(zhuǎn)基因動物研究中，通過將GFP基因轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞或組織中，科學(xué)家可以用熒光顯微鏡觀察其在生物中的位置和運(yùn)動軌跡，繁殖情況以及基因表達(dá)水平等重要信息。

肌肉是非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的良好場所，可以長時間表達(dá)基因產(chǎn)物，且在體內(nèi)容易被觸及。通過骨骼肌轉(zhuǎn)染治療性基因，可用于治療進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良等肌肉本身疾病，還可以用于表達(dá)血管生成因子治療肢體缺血性疾病或合成疫苗等。然而，單純肌肉注射裸基因或者含有報告基因的質(zhì)粒其表達(dá)水平極低，不易獲得具有顯著性的有效結(jié)果。

1998年，Mir等提出了肌肉基因電轉(zhuǎn)染的新方法，通過細(xì)胞電通透作用，可以簡單而又有效地將非病毒載體基因轉(zhuǎn)入動物肌肉，包括靈長類動物。肌肉基因電轉(zhuǎn)染成為研究的熱門領(lǐng)域，并有望將來被用于腫瘤、貧血等疾病的臨床治療。本研究旨在探討肌肉基因電轉(zhuǎn)染的條件，為后續(xù)利用肌肉進(jìn)行抗腫瘤基因的電轉(zhuǎn)染研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.1 質(zhì)粒

pEGFP-C1綠色熒光蛋白質(zhì)粒，由吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心惠贈（以下稱為EGFP質(zhì)粒）。EGFP質(zhì)粒置于大腸E.coli菌JM109內(nèi)擴(kuò)增，堿裂解法提取、純化。瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒，其中超螺旋結(jié)構(gòu)占70%～80%，無RNA殘留。質(zhì)粒溶解于K-PBS溶液（NaCl 30.8 mmol·L?1、KCl 20.7 mmol·L?1、Na?HPO? 8.1 mmol·L?1、KH?PO? 1.46 mmol·L?1、MgCl? 10 mmol·L?1溶解于雙蒸水）中，定量，調(diào)節(jié)質(zhì)粒濃度為1 g·L?1。

1.2 動物

昆明系小白鼠購于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，共160只，4～6周齡，體重18～20 g，雌雄各半，隨機(jī)分組，每組8只。

1.3 電通透儀

電通透儀由方波電脈沖發(fā)生器和針式電極組成（自行研制）。方波電脈沖發(fā)生器輸出電脈沖主要指標(biāo)：電場強(qiáng)度0～2500 V·cm?1，脈沖時值0～100 ms，脈沖次數(shù)0～15次，脈沖頻率0～10 Hz。針式電極為雙針電極，正負(fù)極間距0～1 cm，為銀制電極。

1.4 肌肉基因電轉(zhuǎn)染參數(shù)的確定

濃度為1 g·L?1質(zhì)粒根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要量注射到小鼠的脛前肌，注射后給予電脈沖，針式電極間距0.6 cm、次數(shù)8次、頻率1 Hz為固定參數(shù)。1周后處死動物，取小腿脛前肌冰凍切片后熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4.1 電場強(qiáng)度和脈沖時值的確定

EGFP質(zhì)粒DNA 15 μg，注入30 s后給予電脈沖。按電場強(qiáng)度和脈沖時值共分為8組，即20和50 ms組分別給予電場強(qiáng)度0、100、200和400 V·cm?1。觀察不同電場強(qiáng)度和脈沖時值對轉(zhuǎn)染率的影響。其中，0 V·cm?1的20和50 ms組相當(dāng)于單純質(zhì)粒肌肉注射實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 注入質(zhì)粒劑量的確定

電場強(qiáng)度200 V·cm?1、脈沖時值20 ms，注入30 s后給予電脈沖。按質(zhì)粒DNA注入的量分為3組，即7.5、15和30 μg組。

1.4.3 注入質(zhì)粒后給予電脈沖的時間間隔的確定

質(zhì)粒DNA 15 μg，電場強(qiáng)度200 V·cm?1、脈沖時值20 ms。按注入后給予電脈沖的時間間隔分為2組，即注入質(zhì)粒30 s后給予電脈沖（electric pulse, EP）組和注入質(zhì)粒1 h后給予EP組。

1.4.4 轉(zhuǎn)染后DNA表達(dá)最佳時間的確定

質(zhì)粒DNA 15 μg，電場強(qiáng)度200 V·cm?1、脈沖時值20 ms，注入30 s后給予電脈沖。按轉(zhuǎn)染后處死動物進(jìn)行觀察的時間不同分為7組，即按處死動物的不同時間分為轉(zhuǎn)染后第1、3、7、14、21、28和35 d組。

1.5 轉(zhuǎn)染陽性肌纖維的確定

所取的骨骼肌標(biāo)本先迅速置于液氮中冰凍，然后保存在-80℃冰箱中。取轉(zhuǎn)染區(qū)骨骼肌做冰凍切片，厚度為100 μm，熒光顯微鏡下觀察到陽性轉(zhuǎn)染的肌纖維發(fā)出綠色熒光。發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，切片厚度改為12 μm，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，與光鏡下對比后計(jì)數(shù)，按以下公式計(jì)算轉(zhuǎn)染率。

結(jié)果

EGFP質(zhì)粒15 μg注射到小鼠的脛前肌，在注入后給予如下參數(shù)，即電脈沖200 V·cm?1，20 ms，1 Hz，8次，轉(zhuǎn)染率最高，可達(dá)（73.2±7.2）%。EGFP質(zhì)粒注射后不會在細(xì)胞外立即降解，注射質(zhì)粒DNA 1 h內(nèi)給予電脈沖不影響轉(zhuǎn)染率；15 μg為適當(dāng)?shù)腄NA劑量；EGFP蛋白的表達(dá)，7 d達(dá)到高峰。

討論

2.1 電轉(zhuǎn)染法優(yōu)化參數(shù)的確定

本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，確定了肌肉基因電轉(zhuǎn)染的最佳參數(shù)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)EGFP質(zhì)粒劑量為15 μg，電場強(qiáng)度為200 V·cm?1，脈沖時值為20 ms，脈沖頻率為1 Hz，脈沖次數(shù)為8次時，轉(zhuǎn)染率最高，可達(dá)（73.2±7.2）%。這一結(jié)果為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了重要的參考依據(jù)。

2.2 電轉(zhuǎn)染法提高轉(zhuǎn)染率的機(jī)制

與單純EGFP質(zhì)粒肌肉注射相比，DNA肌肉電轉(zhuǎn)染可極大地提高其轉(zhuǎn)染率。這一結(jié)果可能與細(xì)胞電通透作用有關(guān)。細(xì)胞電通透是一種利用短暫的高壓電脈沖改變細(xì)胞膜通透性的技術(shù)，可使細(xì)胞膜形成微小孔洞，允許外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。本研究通過優(yōu)化電脈沖參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了高效、安全的DNA肌肉轉(zhuǎn)染。

2.3 電轉(zhuǎn)染法在基因治療中的應(yīng)用前景

肌肉是非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的良好場所，可以長時間表達(dá)基因產(chǎn)物，且在體內(nèi)容易被觸及。通過骨骼肌轉(zhuǎn)染治療性基因，可用于治療進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良等肌肉本身疾病，還可以用于表達(dá)血管生成因子治療肢體缺血性疾病或合成疫苗等。本研究為肌肉基因電轉(zhuǎn)染提供了優(yōu)化參數(shù)，為基因治療及體內(nèi)基因表達(dá)研究提供了新思路和應(yīng)用前景。

2.4 研究的創(chuàng)新點(diǎn)

本研究創(chuàng)新性地將細(xì)胞電通透技術(shù)應(yīng)用于DNA肌肉轉(zhuǎn)染，并通過優(yōu)化電場強(qiáng)度、脈沖時值和質(zhì)粒劑量等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了高效電轉(zhuǎn)染。此外，本研究還通過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了電轉(zhuǎn)染法的安全性和可行性，為基因治療及體內(nèi)基因表達(dá)研究提供了新思路和應(yīng)用前景。

結(jié)論

本研究將細(xì)胞電通透技術(shù)應(yīng)用于DNA肌肉轉(zhuǎn)染，通過優(yōu)化電場強(qiáng)度、脈沖時值和質(zhì)粒劑量等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了高效電轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)EGFP質(zhì)粒劑量為15 μg，電場強(qiáng)度為200 V·cm?1，脈沖時值為20 ms，脈沖頻率為1 Hz，脈沖次數(shù)為8次時，轉(zhuǎn)染率最高，可達(dá)（73.2±7.2）%。與單純EGFP質(zhì)粒肌肉注射相比，DNA肌肉電轉(zhuǎn)染可極大地提高其轉(zhuǎn)染率。本研究為肌肉基因電轉(zhuǎn)染提供了優(yōu)化參數(shù)，為基因治療及體內(nèi)基因表達(dá)研究提供了新思路和應(yīng)用前景。