綿羊作為全球畜牧業(yè)關(guān)鍵畜種，其繁殖效率及生殖細(xì)胞質(zhì)量直接關(guān)聯(lián)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。近年來，天然活性物質(zhì)白藜蘆醇與褪黑素在動(dòng)物生殖領(lǐng)域備受矚目。白藜蘆醇具強(qiáng)抗氧化、抗炎效能，能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路；褪黑素于晝夜節(jié)律調(diào)控及自由基清除作用突出，二者于綿羊細(xì)胞及卵母細(xì)胞層面潛在價(jià)值亟待深挖，本研究應(yīng)運(yùn)而生。
綿羊卵巢采集自當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)，離體 2 小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，于預(yù)冷生理鹽水中保存，用于卵母細(xì)胞采集。
細(xì)胞系選用綿羊成纖維細(xì)胞，由實(shí)驗(yàn)室前期分離培養(yǎng)并凍存，復(fù)蘇后傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。
白藜蘆醇、褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品購自藥企，純度超 98%，以二甲基亞砜（DMSO）配制成母液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配，確保 DMSO 終濃度低于 0.1%，排除其干擾。
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、白藜蘆醇低劑量組（1 μmol/L）、白藜蘆醇高劑量組（10 μmol/L）、褪黑素低劑量組（100 nmol/L）、褪黑素高劑量組（1 μmol/L）及聯(lián)合用藥組（白藜蘆醇 1 μmol/L + 褪黑素 100 nmol/L），每組設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔。
卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)依相同劑量梯度分組，每組至少 30 枚卵母細(xì)胞，重復(fù) 3 次，確保樣本代表性。
細(xì)胞處理：將綿羊成纖維細(xì)胞接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 小時(shí)貼壁后換液，分別加入含不同藥物濃度培養(yǎng)基，孵育特定時(shí)長(zhǎng)（24、48、72 小時(shí)），對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激指標(biāo)等。
卵母細(xì)胞操作：采用機(jī)械法結(jié)合酶解法獲取卵丘 - 卵母細(xì)胞復(fù)合體，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)體系預(yù)平衡后，加入藥物處理，培養(yǎng) 24 小時(shí)觀察成熟率，后續(xù)行孤雌激活評(píng)估早期胚胎發(fā)育潛能，記錄卵裂、囊胚形成數(shù)據(jù)。
細(xì)胞活性以 CCK - 8 法測(cè)定，吸光度值間接反映存活細(xì)胞數(shù)量；細(xì)胞凋亡借 Annexin V - FITC/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)分析，精準(zhǔn)量化凋亡比例；活性氧（ROS）水平用 DCFH - DA 熒光探針標(biāo)記，熒光強(qiáng)度與 ROS 呈正相關(guān)。
卵母細(xì)胞成熟依第一極體排出判定，成熟率 = 排出第一極體卵母細(xì)胞數(shù) / 總卵母細(xì)胞數(shù) ×100%；胚胎發(fā)育潛能觀察卵裂期胚胎數(shù)量及囊胚形成率，囊胚率 = 囊胚數(shù) / 卵裂胚胎數(shù) ×100%。
細(xì)胞活性：與對(duì)照組相較，白藜蘆醇及褪黑素各劑量組處理 48 小時(shí)后顯著提升綿羊成纖維細(xì)胞活性（P < 0.05），聯(lián)合用藥組增幅尤為突出，高劑量白藜蘆醇單藥效果次之，表明二者具協(xié)同促增殖潛能。
抗氧化能力：藥物處理組 ROS 水平呈劑量依賴性降低，褪黑素高劑量組 72 小時(shí)降幅達(dá) 45%，白藜蘆醇組亦有效抑制氧化應(yīng)激，聯(lián)合組 ROS 清除效率超 60%，同時(shí)抗氧化酶（SOD、CAT）活性增強(qiáng)，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。
抗凋亡表現(xiàn)：流式結(jié)果顯示，處理組凋亡細(xì)胞比率顯著減少，白藜蘆醇通過激活 PI3K/Akt 通路抑制線粒體途徑凋亡，褪黑素則上調(diào)抗凋亡蛋白 Bcl - 2，聯(lián)合用藥近乎消除早期凋亡峰，全方面守護(hù)細(xì)胞存活。
體外成熟：白藜蘆醇與褪黑素顯著加速卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程，高劑量組成熟率較對(duì)照組提升約 18%（P < 0.05），聯(lián)合用藥使成熟時(shí)間提前約 2 小時(shí)，皮質(zhì)顆粒分布更均勻，預(yù)示受精能力增強(qiáng)。
胚胎發(fā)育：經(jīng)孤雌激活，處理組卵裂率及囊胚率大幅改善，褪黑素助力早期卵裂，白藜蘆醇促進(jìn)囊胚形成及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)增殖，聯(lián)合組囊胚發(fā)育至孵化階段比例明顯增加，胚胎質(zhì)量顯著優(yōu)化，為后續(xù)胚胎移植奠基。
本研究揭示白藜蘆醇與褪黑素協(xié)同賦能綿羊細(xì)胞及卵母細(xì)胞。在細(xì)胞體系，二者多靶點(diǎn)協(xié)作，抗氧化防線穩(wěn)固，抗凋亡網(wǎng)絡(luò)致密，從分子層面保障細(xì)胞功能完整性，為綿羊體細(xì)胞保存、基因編輯供體優(yōu)化提供新思路；于卵母細(xì)胞，不僅成熟效率飆升，胚胎發(fā)育全程護(hù)航，直擊畜牧繁育關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，有望革新綿羊輔助生殖策略，從源頭提升種群繁殖力，然具體分子對(duì)話機(jī)制及長(zhǎng)期應(yīng)用安全性尚待深挖，后續(xù)研究可期。
白藜蘆醇與褪黑素單用及聯(lián)用對(duì)綿羊細(xì)胞及卵母細(xì)胞裨益顯著，可作天然高效生物添加劑用于綿羊繁殖產(chǎn)業(yè)，經(jīng)精準(zhǔn)劑量調(diào)配與應(yīng)用場(chǎng)景拓展，有望重塑綿羊養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益版圖，為畜牧科技進(jìn)階注入活力，助力產(chǎn)業(yè)綠色、高效、可持續(xù)發(fā)展征程。后續(xù)宜聚焦體內(nèi)驗(yàn)證及產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化關(guān)鍵技術(shù)攻堅(jiān)，促科研成果落地生根。
